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实验貌似顺利
所以改贴protocol...

非变性蛋白电泳

非变性蛋白电泳中蛋白保持非变性（自然）状态，所以能用以区分分子量一样但分子构型不一样的蛋白。但由于蛋白没

有变性，在电泳时它的移动速率还受到分子形状的影响，因此非变性PAGE的结果不能用以区分蛋白分子量大小。
实验过程和SDS-PAGE基本相同，只是去除所有导致蛋白变性的因素（如loading buffer中的巯基乙醇，running buffer中

的sds等）并采取措施尽量保持蛋白在电泳过程中不被降解。

方法一（出自《蛋白质与蛋白质组学实验指南》）

试剂：

30%丙烯酰胺
AP（10%）
电泳缓冲液：3g tris base + 14.4g glycine 去离子水定容至1L，最终pH为8.3
5X loading buffer：
 1M tris-HCl (pH 6.8)  15.5ml
 1%溴酚蓝  2.5ml
 去离子水  7ml
 甘油   25ml
样品若是固体，直接将样品溶于1X loading buffer中，若为液体，则将样品溶液与5X buffer混合使其终浓度为1X buffer

分离胶缓冲液：1.5M Tris-HCl (pH 8.8）
积层胶缓冲液：0.5M Tris-HCl (pH 6.8）
TEMED

配胶、跑胶及染色与SDS-PAGE相似

方法二（出自《Practical Protocols in Molecular Biology》）

试剂：
 40% 丙烯酰胺
 AP（10%）
 TEMED
 缓冲系统（从下面三种中择其一）
 high pH buffer：
  积层胶：6.0g Tris-HCl 40ml 用盐酸将pH调至6.8，定容至100ml
  分离胶：36.6g Tris-HCl 40ml 用盐酸将pH调至8.8，定容至100ml
  电泳缓冲液：3g Tris, 14.4g glycine，pH8.8，加水至1L

 neutral buffer
  积层胶：4.95g Tris-HCl 40ml 用盐酸将pH调至5.5，定容至100ml
  分离胶：36.6g Tris-HCl 40ml 用盐酸将pH调至7.5，定容至100ml
  电泳缓冲液：5.52g diethylbarbuturic acid，1g Tris, 14.4g glycine，pH8.8，加水至1L

 low pH buffer：懒得写了……

 缓冲系统的选择：高离子强度的缓冲液中蛋白移动速率较慢，选择低离子强度缓冲液时，则要注意电泳电流要小。另外建议不使用积层胶，因为它有可能导致蛋白聚集和沉淀，但也有报告指出使用积层胶能使蛋白条带更好。

1）配胶，过程同SDS-PAGE
2）预电泳：125伏 20min（不加样品）
3）上样：每孔上样量为5~20ul，蛋白含量控制在15~20ug左右；每个样品加10ul loading buffer ( 40% 蔗糖溶液，0.05%溴酚蓝）
4）跑胶：（4C中进行）
 15伏  15min
 70v  20min
 125v  至电泳结束
5）有关marker：因为上样的蛋白可能和标准蛋白有一定差距，所以最好引入一系列已知分子量的蛋白（如BSA）以作参照物

打字好困……已经不知道自己再打什么了
自己的改良方案等明天出结果在写吧（如果有好结果的话...）    


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